Осмотическая резистентности эритроцитов (ОРЭ)

Как проводится процедура

Обычно перед проведением лабораторных исследования больному необходима подготовка. Но диагностика методом ОРЭ не подразумевает специального режима питания, отказа от чего-либо. Сама процедура заключается во взятии пункции крови из вены, которая набирается в пробирку с гепарином. Если после этого у пациента появилась гематома, для её удаления нужно применить согревающий компресс. Следует уточнить, что исследование также имеет минусы, среди них:

• Длительность выполнения.
• Трудоёмкость.

Существуют разные модификации исследования ОРЭ:

1. Визуальный способ Лимбека и Рибьера. Во время диагностики по 20 мл. капилярной крови добавляют в пробирки, где имеется по 10 мл. раствора NaCL. Далее смесь нужно выдержать один час, в это время в комнате должна быть температура не меньше 15 и не больше 25 градусов. После используют цетрифугирование на протяжении трёх минут, при 2000 об/мин. Завершив эти действия, лаборант приступает к определению максимального, минимального уровня резистентности. Этот метод заключается в использовании немалого количества крови, характеризуется низкой точностью, а также не следует общепринятым нормативам.
2. Колориметрический – подразумевает прямое определение концентрации гемоглобина, который выходит из эритроцитов во время гемолиза. В пробирки, куда заблаговременно был добавлен раствор NaCl, добавляют эритроциты, а после гемометром Сали устанавливают концентрацию гемоглобина. Затем чертят кривую гемолиза. Способ имеет такие же недостатки, как и предыдущий.
3. Метод Л.И.Идельсона. Берут пару пробирок, куда предварительно добавляют по две капли гепарина, а после по 1,5 мл. крови из вены. Одну смесь изучают сразу, а второй дают постоять сутки в термостакане, температура в котором должна быть 37 градусов. Так, для первой диагностики, берут 14 цетрифужных пробирок, куда требуется разлитие по 5 мл. NaCl, концентрация данного раствора должна достигать 1,0 %, и добавляют также по 0,02 мл. крови из первой пробирки с гепарином. Эти ёмкости должны выдержаться полчаса, а затем они центрифугируются при 2000 об/мин. Завершает процедуру фотоколориметрирование насадочной жидкостью, характеризующейся содержанием 1% раствора хлорида натрия. И только потом осуществляется определение интенсивности гемолиза. Такие же действия проводят и со второй пробиркой, которая должна выдержаться сутки.
4. Ещё один способ заключается в смешивании в кювете спектрофотометра эритроцитов вместе с раствором NaCl и регистрации оптической плотности. Длина волны здесь достигает 650 нм, а температура комнаты 20 градусов. Одним из главных минусов способа является обязательное наличие спецоборудования.
5. Регистрация оптической плотности растворов, содержащих NaCL, во время прохождения света с волновой длиной в 670-750 нм. Диагностика проводится за несколько минут.
6. Модификация метода Л.И.Идельсона. Берут три пробирки с 0,01 мл. крови в каждой, эта смесь на протяжении 10 минут проходит центрифугирование, при 2000 об/мин. Далее с помощью спектрофотометра, длина волны которого 414 нм, оценивается, как происходит световой поглощение надосадочной жидкостью. Данный способ сократил трудоёмкость, затраты на лабораторную посуду, но все же имеется и недостаток. Так, интенсивность поглощения может меняться из-за формы гемоглобина.

Определения осмотической резистентности эритроцитов

Признаки нарушения устойчивости

Нарушение ОРЭ сопровождается следующими симптомами:

1. Упадком сил.
2. Отсутствием аппетита.
3. Быстрой общей усталостью.
4. Падением веса тела.
5. Постоянной сонливостью.
6. Бледностью слизистых.
7. Значительным повышением температуры.

При падении устойчивости, эритроциты помечаются системой иммунитета (маркерами), и выводятся из организма селезенкой. При этом печень не успевает нейтрализовать выделившийся при разрушении клеток билирубин, в результате развивается гемолиз. При развитии такого процесса анализ крови показывает недостаток красных клеток, а организм испытывает дефицит кислорода.

Показатели нормы

Норма резистентности для взрослого человека независимо от пола является следующей (%):

1. Максимальная – 0,34-0,32.
2. Минимальная – 0,48-0,46.

В детском возрасте до 2 лет осмотическая устойчивость несколько выше нормального показателя, а норма ОРЭ у пожилых людей, как правило, ниже от стандартного минимального показателя.

Отклонения от нормы

Резистентность и прочность мембран эритроцитов находятся в зависимости от наследственных заболеваний или особенностей патологии.

Причинами роста или падения ОРЭ выступают следующие факторы:

1. Повышение стойкости эритроцитов наблюдается при механической желтухе, когда на них оседают холестериновые отложения, приобретенном или наследственном сфероцитозе, стомацитодозе, различных формах гемоглобиноза.
2. Значительная кровопотеря способствует перенасыщению крови незрелыми эритроцитами и истончению их мембран. Эти же признаки характерны при наличии онкогематологии, железодефицитной анемии, иммуносекретирующих опухолей и гемоглобинопатий.

Отдельные сердечно-сосудистые болезни вызывают насыщение крови уплощенными эритроцитами, имеющими небольшой индекс сферичности, а некоторые наследственные заболевания – клетками, имеющими чрезмерно шарообразную форму. Клетки с подобными аномалиями характерны плохой резистентностью.

Причины снижения ОРЭ:

1. Сердечная недостаточность, вызывающая набухание до приобретения клетками сферической формы.
2. Генетически обусловленная аномалия, когда в крови находятся шарообразные эритроциты.
3. При старении эритроцитов и на последних этапах их жизненного цикла. В этот период клетки становятся округлыми, а проницаемость стенок заметно возрастает.

Границы устойчивости

Обычно по результатам исследования выявляется верхняя, нижняя граница стойкости клеток крови.

Нижняя соответствует концентрации, при использовании которой начинают распадаться первые слабые эритроциты.

Верхняя – концентрация, когда полный гемолиз проходит за 3 часа.

Итак, снижение показателей до 0,32% и меньше диагностируется при больших кровопотерях, при застойной желтухе, как итог проведения операции по резекции селезенки.

Значительное превышение – от 0,48% – развивается при гемолитической анемии у грудничков, после отравления свинцом.

Изучение границ ОРЭ

Расширение границ фиксируется при остром течении пернициозной анемии, гемолитическом кризе.

ОРЭ характеризуется диагностикой устойчивости оболочки эритроцитов к патологическим для них факторам. Полноценные здоровые клетки отличаются хорошей стойкостью оболочки после появления из системы кроветворения. Минимальная резистентность у них возникает только при старении, в конце цикла жизни. Затем такие клетки маркируются иммунитетом, организм утилизирует их в селезенке.

Основной способ выявления ОРЭ – это взаимодействие гипотонического раствора разной концентрации и крови. Анализ помогает обследовать стабильность оболочки эритроцитов, отметить границы резистентности.

Итак, более устойчивыми являются молодые плоские клетки, они появляются в крови сразу из костного мозга. Их сферичность стремится к нулю.

Способы обследования

Чаще обследование организуется при помощи уникальной методики на установление устойчивости Л.И. Идельсона. Реактивом становится 10%-й раствор. Хранят его в емкости с крышкой в холодильнике по несколько месяцев.

Раствор в десять раз разводится дистиллированной водой, а уже из него делают много рабочих разной концентрации – по 100 мл, тоже при необходимости убирают в холодильник, могут применять в последующие 2 недели.

Из оборудования также потребуется термостат 37 градусов и фотоэлектроколориметр.

У человека с нормальным здоровьем гемолиз крови начинается при 0,5-0,45%, полный распад отмечается при 0,4-0,35%.

Метод Л.И. Идельсона

Данный метод исследования реализуется в случае высокой вероятности обнаружения гемолитической анемии. Тогда гемолиз происходит при концентрации равной 0,75-0,7%.

Снижение устойчивости отмечается при наследственных анемиях, аутоиммунной анемии. Повышение возникает на фоне талассемии, механической желтухи.

Есть и другие модификации изучения нормальной устойчивости клеток, а именно:

1. Визуальный метод ученых Рибьера и Лимбека. Для диагностики требуется по 20 мл капиллярной крови добавить в пробирки, где уже есть 10 мл раствора NaCl. Смесь оставляют на час при температуре 15-25 градусов. Затем раствор центрифугируют 3 минуты на скорости 2000 оборотов в минуту. Только потом лаборант начинает устанавливать минимум и максимум резистентности. Данный способ требует немалого объема крови, его главный недостаток – небольшая точность и несоответствие общепринятым нормативам.
2. Колориметрический метод. Он предполагает прямое выявление концентрации гемоглобина, вырабатываемого эритроцитами при гемолизе. В пробирки сначала помещается раствор NaCl, затем эритроциты. Потом с помощью гемометра Сали высчитывается содержание гемоглобина, чертится кривая гемолиза. У данного метода сохраняются недостатки предшествующего.
3. Смешивание эритроцитов и раствора в спектрофотомере, фиксирование оптической плотности. Длина волны составляет примерно 650 нм, температура в комнате 20 градусов. Главный недостаток – необходимость использования специального оборудования.
4. Регистрация оптической плотности солевого раствора при прохождении через него световой волны длиной 650-750 нм. Диагностика занимает всего несколько минут.

Также есть более усовершенствованный способ Л.И. Идельсона. Для этого нужно 3 пробирки – в них по 0,01 мл крови. Ее центрифугируют 10 минут, а потом с помощью спектрографа и волны длиной 414 нм оценивают световое поглощение жидкости над осадком. Этот метод помогает сократить трудоемкость анализа, снизить затраты на лабораторные емкости. Но и у него есть минус – интенсивность поглощение меняется под влиянием разных форм гемоглобина.

Проведение

Выявление ОРЭ реализуется посредством добавления одинакового объема крови, обычно 0,22 мл, в раствор различной концентрации – от 0,7 до 0,22%. Спустя 60 минут выдерживания смесь подвергается центрифугированию. По цвету жидкости фиксируется начало гемолиза, затем его полное прохождение.

В самом начале жидкость светло-розовая. Насыщенный оттенок свидетельствует о завершении распада эритроцитов. Итоги фиксируются двумя цифрами – минимальной и максимальной резистентностью.

Методика измерения осмотической резистентности

Тест на определение резистентности эритроцитов

Клетки крови способны нормально функционировать в изотоническом растворе (содержание ионов NaCl не превышает 0,85%). Такая концентрация NaCl соответствует количеству ионов соли в сыворотке крови. Те растворы, которые содержат большее количество солей, называются гипертоническими, а меньшее — гипотонические. Мембраны клеток, помещенных в такие растворы, быстро разрушаются.

Эритроциты здорового человека способны выдерживать изменения осмотического давления, то есть обладать прочной оболочкой. Для определения стойкости мембран клеток крови используют следующую методику:

1. В пробирки помещается раствор NaCl c разной степенью концентрации (начиная от самой большой — 0,7%, до наименьшей — 0,22%);
2. В каждую пробирку добавляется небольшое количество крови (не более 0,02 мл);
3. В течение следующего часа пробирки держат при температуре в 22-23°C;
4. Полученные растворы центрифугируют и по цвету содержимого высчитывают примерное время начала разрушения клеток крови и момент их полного гемолиза;

Чуть розовый раствор свидетельствует о том, что эритроциты только начали разрушаться, тогда как ярко-красный цвет — знак того, что произошел полный распад клеток.

При помощи этого анализа определяют минимальную и максимальную осмотическую резистентность кровяных телец. Максимальная соответствует тому значению содержания NaCl, при котором происходит полное разрушение клеток крови. Минимальная же определяется тем количеством, при котором клетки разрушаются меньше всего.

Свойства эритроцитов

Эритроциты обладают физиологическими и физико-хими­ческими свойствами: 1) пластичностью; 2) осмотической стойкостью, 3) наличием креаторных связей; 4) способностью к оседанию; 5) агрегацией; 6) деструкцией.

Пластичность во многом обусловлена строением цитоскелета, в котором очень важным является соотношение фосфолипидов и холестерина. Это соотношение выражается в виде липолитического коэффициента и в норме составляет 0,9. Пластичность эритроцитов – способность к обратимой деформации при прохождении через узкие капилляры и микропоры. При снижении количества холестерина в мембране наблюдается снижение стойкости эритроцитов.

Осмотическое давление в клетках немного выше, чем в плазме, за счет внутриклеточной концентрации белков. Также на осмотическое Давление оказывает влияние и минеральный состав (в эритроцитах преобладает калий и снижено содержание ионов Na). За счет наличия осмотического давления обеспечивается нормальный тургор.

В настоящее время установлено, что эритроциты являются идеальным переносчиками, поскольку обладают креаторными связями, транспортируют различные вещества и осуществляют межклеточное взаимодействие.

Способность к оседанию обусловлена удельным весом клеток, который выше, чем все плазмы крови. В норме она невысока и связана с наличием белков альбуминовой фракции, которые способны удерживать гидратную оболочку эритроцитов. Глобулины являются лиофобными коллоидами, которые препятствуют образованию гадратной оболочки. Соотношение альбуминовой и глобулиновой фракций крови (белковый коэффициент) определяет скорость оседания эритроцитов. В норме он составляет 1,5-1,7.

При уменьшении скорости кровотока и увеличении вязкости наблюдается агрегация. При быстрой агрегации образуются «монетные столбики» – ложные агрегаты, которые распадаются на полноценные клетки с сохраненной мембраной и внутриклеточной структурой. При длительном нарушении кровотока появляются истинные агреганты, вызывающие образование микротромба.

Деструкция (разрушение эритроцитов) происходит через 120 дней в результате физиологического старения. Оно характеризуется: 1) постепенным уменьшением содержания липидов и воды в мембране; 2) увеличенным- выходом ионов К и Na; 3) преобладанием метаболических сдвигов; 4) ухудшением способности к восстановлению метгемоглобина в гемоглобин; 5) понижением осмотической стойкости, приводящей к гемолизу.

Стареющие эритроциты за счет понижения способности к деформации застревают в миллипоровых фильтрах селезенки, где поглощаются фагоцитами. Около 10 % клеток подвергаются разрушению в сосудистом русле.

Описание

Под осмотической резистентностью эритроцитов понимается их устойчивость по отношению к гипотоническим растворам натрия хлорида. Минимальная резистентность эритроцитов определяется максимальной концентрацией гипотонического раствора натрия хлорида (в серии растворов с постепенно уменьшающейся концентрацией), при которой начинается гемолиз наименее устойчивых эритроцитов, находящихся в растворе в течение 3 ч; максимальная — минимальной концентрацией гипотонического раствора натрия хлорида, вызывающего в течение 3 ч гемолиз всех эритроцитов крови, помещенных в этот раствор.

Под минимальной осмотической резистентностью эритроцитов понимают максимальную концентрацию гипотонического раствора натрия хлорида, при которой начинается гемолиз наименее устойчивых эритроцитов, которые находятся в растворе 3 часа. Под максимальной осмотической резистентостью эритроцитов понимают минимальную концентрацию гипотонического раствора хлорида натрия, вызывающего в течение 3 часов гемолиз всех эритроцитов, помещенных в раствор.

Максимальная осмотическая резистентность ниже 0,32 % возможна после больших кровопотерь и спленэктомии, при гемоглобинозе С, застойных желтухах, а также в некоторых случаях полицитемии. Повышение осмотической резистентности эритроцитов ниже 0,32 % характерно для талассемии и гемоглобинопатии.

Минимальная осмотическая резистентность выше 0,48 % наблюдается при семейной гемолитической анемии, гемолитической анемии новорожденных и отравлении свинцом. Можно обнаружить небольшие изменения и при токсикозах, бронхопневмониях, туберкулезе, малярии, лейкемии, миелосклерозах, лимфогранулематозе, циррозе печени.

Сниженная осмотическая стойкость эритроцитов в гипотонических растворах свидетельствует об структурных дефектах мембраны эритроцита, обусловленных генами мембранных белков. В отличии от сфероцитоза при гемоглобинопатиях (талласемии и S-гемоглобинопатии) возникает относительный избыток мембраны, что ведет к увеличению осмотической стойкости клеток для гипотонического лизиса, поэтому тест позволяет проводить дифф.диагноз между наиболее частыми причинами наследственных гемолитических анемий.

Механизм работы

Осмотическая резистентность обеспечивается благодаря наличию осмотического градиента между внутренней и внешней средой клетки. Внутри эритроцитов концентрация некоторых ионов, в основном, калия, намного выше, чем в плазме крови. В то время как внешняя среда, обычно, содержит больше натрия. Этот разница в концентрации создает осмотическое давление, препятствуя выходу воды из эритроцитов.

Мембрана эритроцита играет важную роль в поддержании осмотического равновесия. Она состоит из липопротеинов и фосфолипидного бислоя, которые образуют двойной липидный слой. Этот барьер позволяет эритроцитам быть проницаемыми для воды и некоторых молекул, но не позволяют проникать ионам и другим веществам.

Если мембрана эритроцита повреждается или нарушается ее целостность, осмотическое давление приводит к выходу воды из клеток и их становится меньше, изменяется их форма. Это может привести к гемолизу – разрушению эритроцитов и высвобождению их содержимого в плазму крови.

Осмотическая резистентность эритроцитов имеет важное значение для организма. Она позволяет клеткам выполнить свои функции в теле человека и поддерживать его жизнедеятельность

Нарушение осмотической резистентности может быть связано с различными заболеваниями, такими как анемия, нарушение функции почек или наследственные патологии.

Тест на осмотическую резистентность эритроцитов – методика, показатели нормы

Принцип теста на осмотическую резистентность эритроцитов. При погружении эритроцитов в гипотонический раствор наблюдается сокращение отношения площадь/объем с последующим набуханием и расплавлением. Испытание заключается в фотоколориметринеском определении гемоглобина, выделяемого эритроцитами, погруженчыми в солевой раствор, гипотонические значения которого повышаются.

Материалы, реагенты для теста на осмотическую резистентность эритроцитов: пробирки на 10/100 мм; градуированные пипетки на 1 и 2 мл; штативы; флаконы на 100 мл; фотоколориметр; солевой раствор — запас: 18 г NaCl; 2,73г Na2HPО4; 0,374 г NaH2PО4; 200 мл дистилированной воды. Приготовленный таким образом раствор сохраняется месяцами в закупоренном пробкой флаконе.

Из запасного раствора приготовляются гипотонические растворы следующих концентраций: 0,9, 0,75, 0,65, 0,60, 0,55, 0,50, 0,45, 0,40, 0,35, 0,30, 0,20, также 0,10% NaCl, в объемах 50 мл, которые сохраняются несколько недель при температуре +4°С. Гипотонический раствор приготовляется следующим образом: 13 флаконов на 100 мл помечаются цифрой желаемого получить разведения солевого раствора; из имеющегося в запасе раствора отбираем объем в 10 раз больше отмеченной на флаконе цифры (напр., в флакон, на котором отмечено 0,15% влить 1,5 мл), затем до 100 мл дополнить дистилированной водой. Эритроциты извлекаются из гепаринизованной или дефибринированной свежеотобранной крови.

Техника теста на осмотическую резистентность эритроцитов. В чашу центрифуги влить по 10 мл из каждого раствора. В другую чашу, помеченную, «0» влить 10 мл дистилированной воды.

Нормальные значения гемолиза

Затем в каждую из чаш добавить по 0,1 мл осадка эритроцитов, прогомогенизировать содержимое опрокидыванием посуды и продержать 60 мин. в комнатной температуре. По истечении этого интервала взвесь процентрифугировать для выпадения нерасплавленных эритроцитов и клеточных остатков и отобрать надосадочную массу. В чаше, помеченной «0» гемолиз должен быть полным. Определить оптическую плотность надосадочной массы при 540 нм (или зеленом фильтре) соответственно каждой концентрации солевого раствора. Прочет сделать по сравнению с взвесью эритроцитов, находящихся в чаше с 0,9% NaCl.

Дополнительно определение осмотической резистентность можно провести и на предварительно подвергнутых инкубации эритроцитах, при 37°С. С этой целью 2 мл стерильно отобранной на гепарине крови влить в простерилизованную и закупоренную пробкой чашу центрифуги, вместимостью 10 мл и подвергнуть суточной инкубации, при температуре 37СС. Затем определить осмотическую хрупкость, как описано выше.

Расчет, толкование результатов теста на осмотическую резистентность эритроцитов. В процентном выражении гемолиз каждой чаши расчитывается по формуле: % гемолиза = ОП пробы/ОП в чаше «О» х 100. Нормальные значения приведены в таблице выше.

Повышенная осмотическая резистентность встречается при наследственном сфероцитозе, когда она стойкая после инкубации, также при аутоиммунной гемолитической анемии.

Высокая устойчивость к расплавлению отмечается при гомо- и гетерозиготной талассемии, железодефицитной анемии, после иссечения селезенки, равно как и при иных обстоятельствах увеличения площади эритроцита.